BILOGIA MOLECULAR

La Biología Molecular es el estudio de la vida a un nivel molecular. Esta área se solapa con otros campos de la Biología y la Química, particularmente Genética y Bioquímica. La biología molecular concierne principalmente al entendimiento de las interacciones de los diferentes sistemas de la célula, lo que incluye muchísimas relaciones, entre ellas las del ADN con el ARN, la síntesis de proteínas, el metabolismo, y el cómo todas esas interacciones son reguladas para conseguir un afinado funcionamiento de la célula.
Al estudiar el comportamiento biológico de las moléculas que componen las células vivas, la Biología molecular roza otras ciencias que abordan temas similares: así, p. ej., juntamente con la Genética se interesa por la estructura y funcionamiento de los genes y por la regulación (inducción y represión) de la síntesis intracelular de enzimas (v.) y de otras proteínas. Con la Citología, se ocupa de la estructura de los corpúsculos subcelulares (núcleo, nucléolo, mitocondrias, ribosomas, lisosomas, cte.) y sus funciones dentro de la célula. Con la Bioquímica estudia la composición y cinética de las enzimas, interesándose por los tipos de catálisis enzimática, activaciones, inhibiciones competitivas o alostéricas, etc. También colabora con la Filogenética al estudiar la composición detallada de determinadas moléculas en las distintas especies de seres vivos, aportando valiosos datos para el conocimiento de la evolución.
Sin embargo, difiere de todas estas ciencias enumeradas tanto en los objetivos concretos como en los métodos utilizados para lograrlos. Así como la Bioquímica investiga detalladamente los ciclos metabólicos y la integración y desintegración de las moléculas que componen los seres vivos, la Biología molecular pretende fijarse con preferencia en el comportamiento biológico de las macromoléculas (ADN, ARN, enzimas, hormonas, etc.) dentro de la célula y explicar las funciones biológicas del ser vivo por estas propiedades a nivel molecular.

¿Qué es el DNA?
Podemos considerar el DNA o ácido desoxiribonucleico, como el }cerebro~ celular que regula el número y naturaleza de cada tipo de estructura y composición celular, transmitiendo la información hereditaria y determinando la estructura de las proteínas, que a través de enzimas determinará el resto de funciones celulares.
A finales del siglo pasado se descubrió también la existencia de una segunda clase de ácido nucleico, denominado ácido ribonucleico (RNA). El RNA se encuentra tanto en el núcleo (concretamente en el nucleolo) como en el citoplasma de las células de manera abundante.
Ambos tipos de ácido nucleico, DNA y RNA, se encuentran simultáneamente en organismos eucariotas (con células de núcleo diferenciado) y procariotas (bacterias, etc.), y sólo uno de ellos en los virus.
COMPOSICIÓN DE LOS ÁCIDOS NUCLEICOS
Los ácidos nucleicos polímeros de alto peso molecular constituidos por unidades elementales denominadas }nucleótidos~, los cuales están formados por tres componentes:
1. Molécula de azúcar
ð Ribosa, en el caso del RNA
ð Desoxirribosa, en el caso del DNA
2. Base orgánica nitrogenada
ð Adenina, guanina (bases púricas), citosina y timina (bases pirimidínicas) en el caso del DNA.
ð Adenina, guanina (bases púricas), citosina y uracilo (bases pirimidínicas) en el caso del RNA.
3. Grupos fosfato

Los nucleótidos se unen formando cadenas cuyo esqueleto está formado por la unión entre un azúcar de un nucleótido y el fosfato del siguiente, quedando las bases nitrogenadas en la parte central, unidas cada una al C1 del azúcar. Estas bases son las que rinden especificidad al ácido nucleico.

ESTRUCTURA DEL DNA
Estructura primaria
La estructura primaria viene dada por la secuencia de nucleótidos. Cuando se quiere representar la secuencia de un oligonucleótido o de un ácido nucleico, se representa mediante la terminología de cada una de las bases. Por ejemplo:
5'-ATCCCAGCCCGATTAAAGCC-3'
Esta secuencia representa un oligonucleótido con 20 bases, de las cuales 6 son adeninas (A), 3 son timinas (T), 8 son citosinas (C) y 3 guaninas (G).
El orden de la secuencia es muy importante, ya que en él reside la información contenida en el ácido nucleico; la orientación viene dada en el sentido 5' à 3' ó 3' à 5'; el 5' representa el extremo terminal del fosfato y el 3' el extremo final del átomo de carbono de la desoxirribosa.
Estructura secundaria
Edwin Chargaff analizando las bases del DNA mediante métodos cromatográficos descubre, que éstas no se encuentran en la misma proporción y que el número de adeninas es igual al de timinas y el de citosinas, al de guaninas.
En 1953 James Watson y Francis Crick construyeron un modelo tridimensional del DNA con la configuración más favorable energéticamente combinando los datos obtenidos hasta entonces sobre él, los descubrimientos de Chargaff y la interpretación tridimensional de los espectros de difracción de Rayos X; esto último fue de gran importancia para la consecución de tal modelo, el cual consiste en una doble hélice antiparalela cuyo esqueleto fundamental está formado por las cadenas de azúcar-fosfato, quedando en la parte central las bases, enfrentadas las de una cadena con las de la otra complementaria y formando entre sí puentes de hidrógeno, factor que da estabilidad a la doble hélice. El enfrentamiento de bases es constante; la adenina siempre se enfrenta con la timina y entre sí se forman dos puentes de hidrógeno, y la guanina con la citosina, formándose entre ambas tres puentes de hidrógeno. Esta característica provoca que las dos cadenas sean complementarias. Las dos cadenas de la doble hélice tienen sentidos opuestos, mientras una va en sentido 5' à 3' y la otra lo hace en sentido 3' à 5'. Por eso hablamos del DNA como una doble hélice antiparalela.

Disposición de la unión entre bases formando dos puentes de hidrógeno entre adenina –timina y tres puentes de hidrógeno entre citosina - guanina.


Estructura de doble hélice a derechas del DNA.

Estructuras terciaria y cuaternaria

Teniendo en cuenta que la longitud de una hebra de DNA humano es de varios metros, por necesidad debe adoptar otras estructuras para poder estar en el interior celular. Estas estructuras, terciaria y cuaternaria, permiten el empaquetamiento del DNA formando los cromosomas. En las células eucariotas existen varios cromosomas y en los procariotas, existe un DNA empaquetado denominado seudocromosoma.

ESTRUCTURA DEL RNA
El RNA generalmente está formado por una sola cadena de nucleótidos, aunque existen algunos virus que poseen RNA de doble cadena.
Los ácidos ribonucleicos no sólo pueden tener información propia, sino que constituyen la herramienta para la conversión de la información contenida en el DNA en proteínas específicas.

PROPIEDADES DEL DNA
Las hebras del DNA que forman la hélice tienen orientaciones opuestas: una va en la dirección 5´-3´y su complementaria en la 3´-5´. La ruptura de los puentes de hidrógeno por calor, álcali o diversos compuestos químicos, produce la separación física de las dos hebras del DNA en un proceso denominado desnaturalización. La desnaturalización por calor es total a los 90°C y por álcali a pHs superiores a 11,3. En ambas casos el proceso es reversible, y al desaparecer el agente desnaturalizante se produce la renaturalización de la molécula, esto es, la re-adquisición de la estructura helicoidal perdida. ´
El proceso de desnaturalización va seguido por un aumento de la absorción de luz ultravioleta (260 nm) denominado efecto hipercrómico.
Otro concepto interesante de definir es el de temperatura de fusión (Tm), que es la temperatura a la que la mitad de las moléculas de una solución de ácido nucleico, han pasado a estado desnaturalizado. Esta temperatura depende del número de pares G-C que existan en la molécula de ácido nucleico. Cuando mayor sea este mayor será la Tm.


FUNCIONES DE LOS ÁCIDOS NUCLEICOS

· DNA
Su función principal consiste en la conservación de la información de la célula u organismo que lo contiene y la transmisión de esta información al replicarse.


· RNA
En algunos virus su función es contener y transmitir información. Pero, como hemos citado anteriormente, su función más importante consiste en la conversión de la información contenida en el DNA en proteínas específicas. Para ello existen varios tipos de RNA: RNA mensajero (RNAm), RNA transferente (RNAt) y RNA ribosómico (RNAr).


DOTACIÓN GENÉTICA DE LOS VIRUS Los virus pueden tener DNA duplex, DNA monocatenario, RNA monocatenario o RNA duplex. En algunas ocasiones, el genoma vírico dispone de la información biológica necesaria para que la maquinaria de la célula a la que parasita trabaje para él, y en otras posee la información para realizar por sí mismo las diferentes funciones para su replicación.




DOTACIÓN GENETICAS DE LAS BACTERIAS
Las bacterias, al igual que los organismos eucariotas poseen los dos tipos de ácidos nucleicos antes citados: DNA, componente de su único cromosoma, y los diferentes ácidos ribonucleicos (RNAr, RNAt, RNAm). Además, las bacterias también tienen cierta cantidad extra de DNA que suele encontrarse circularizado y repetido varias veces, denominado DNA extracromosómico o DNA plasmídico y, aunque puede no contener una información específica (plásmido críptico), normalmente codifica factores de resistencia a los antimicrobianos, como b-lactamasas, etc.


Bacteria DNA plasmídico DNA cromosómico

DNA plasmídico

Dotación genómica de una bacteria.



CROMATINA Y CROMOSOMAS
El DNA nunca está desnudo. En eucariotas interacciona con una gran variedad de proteínas, se espiraliza y condensa para formar la cromatina y los cromosomas.

Los cromosomas constituyen el orden superior de empaquetamiento del DNA y se pueden visualizar al microscopio óptico. La unidad estructural por debajo del cromosoma es la fibra de cromatina que se puede visualizar al microscopio electrónico. Esta fibra está compuesta por 6-7 nucleosomas por vuelta. Cada nucleosoma es un disco formado por un octámero de proteínas básicas denominadas histonas, donde exteriormente se enrolla el DNA.



REPLICACION DEL DNA

Como dijimos anteriormente, el DNA está formado por dos hélices complementarias unidas por enlaces débiles de puentes de hidrógeno que pueden romperse y volverse a formar simplemente calentando y enfriando. A estos procesos se les llama respectivamente desnaturalización y renaturalización del DNA.

Partiendo de este concepto y de manera muy esquemática, la replicación del DNA en la naturaleza consiste en:

1. Separación de las dos cadenas que forman la doble hélice, de lo cual se encargan enzimas y proteínas que se encuentran en la célula eucariótica.
2. Unión de los cebadores ('primers' o iniciadores) de RNA en una de las hebras separadas. (3'®5')
3. Unión de la polimerasa a los lugares donde se encuentra el 'primer' para comenzar a copiar de manera progresiva la hebra de DNA, ya que la polimerasa necesita un cebador que le indique dónde empezar, por ser incapaz de copiar DNA monocatenario.
El sentido de la síntesis es siempre 5' à 3'.
4. Constitución de las nuevas copias siempre formadas por una hebra madre y otra hija, por lo que al proceso se le denomina replicación semiconservativa del DNA.
De esta forma, de un DNA parental, tras su replicación, se obtienen dos moléculas hijas exactamente iguales.



Horquilla replicativa del DNA con todas las enzimas implicadas en la síntesis. Es necesaria la existencia de un 'primer' para que la DNA polimerasa de E. coli inicie cadenas de novo. Este 'primer' es proporcionado por una RNA polimerasa llamada primasa, la cual en asociación con un complejo de proteínas llamado primosoma sintetiza una cadena corta de RNA. La DNA polimerasa III puede utilizar este 'primer' para continuar la síntesis de DNA. Una proteína llamada helicasa (originalmente llamada rep) es necesaria para desenlazar y abrir la hélice de DNA para permitir la replicación. Las proteínas de enlace a ssDNA se encargan de estabilizar las regiones de simple cadena que se forman transitoriamente durante el proceso de replicación. La DNA polimerasa puede sintetizar DNA en la dirección 5´ ® 3´, por lo que una de las hebras debe ser sintetizada discontinuamente, esto lleva a la formación de cortas cadenas de DNA con huecos entre ellas que deben ser completados por la acción de la DNA polimerasa I y unidos por la acción de una DNA ligasa.

DOGMA CENTRAL DE LA BIOLOGIA MOLECULAR
¿Cómo hace una molécula de DNA para codificar una proteína?


transcripción traducción
DNA RNA PROTEINA


Transcripción: La información del DNA es transferida al RNAm, que es sintetizado utilizando como molde el DNA original y dirigido por la holoenzima RNA polimerasa. Este RNAm será transportado desde el núcleo a los ribosomas que se encuentran en el citoplasma.
Traducción: La factoría celular responsable de la síntesis de proteínas es el ribosoma. La molécula especifica que va a trasladar los aminoácidos (componentes elementales de las proteínas) siguiendo las pautas dictadas por el RNAm es el RNAt. Cada RNAt tiene un anticodon especifico (formado por tres bases).



Una proteína cargada denominada aminoacil tRNA sintetasa es la encargada de unir el aminoácido correcto correspondiente al anticodon a una posición de anclaje. De esta manera a partir de una señal de iniciación en el RNAm (codon ATG) comienza la síntesis, y el primer aminoácido transportado por el RNAt y correspondiente a este codon es la metionina. Este primer paso se denomina iniciación de la traducción y tiene lugar en una posición concreta del ribosoma denominada aminoacil (A). Posteriormente este RNAt junto con su aminoácido correspondiente salta a una posición contigua denominada peptidil (P)y llega un nuevo RNAt con el correspondiente aminoácido para anclarse en su codon y se sitúa en la posición A que ha quedado libre. Entre ambos aminoácidos se establece una unión peptídica y el RNAt de la posición P es liberado, comenzando el proceso de nuevo. Este proceso de elongación continua hasta llegar a un codon de parada.




Una vez sintetizada la proteína pueden haber modificaciones postranscripcionales (cortes por enzimas proteolíticas, fosforilaciones, glicosilaciones etc...

LA BELLEZA DE LAS MUTACIONES
Sabemos que cada gen es una secuencia de ácido nucleico que transporta información representando un polipeptido particular. Un gen es una entidad estable, pero puede sufrir un cambio en su secuencia. A ese cambio se le llama mutación. Sin embargo las mutaciones son importantes ya que nuestro medio sufre cambios constantes y nosotros debemos cambiar con ellos o quedaremos obsoletos y moriremos.
Uno de los mecanismos de cambio es a nivel del DNA. Las mutaciones pueden dar lugar a nuevos genes y funciones que adapten nuestro organismo a los cambios del medio ambiente en el que vive.

Hay distintos tipos de mutaciones:
Mutaciones cromosómicas:
Translocaciones: Implican un intercambio de grandes fragmentos de DNA entre dos cromosomas diferentes.
Inversiones: Aparecen cuando una región del DNA cambia su orientación respecto al resto del cromosoma.
Delecciones: Perdida de algún fragmento del cromosoma
No disyunción de los cromosomas
Mutaciones puntuales: Consiste en un simple cambio de una base.
Mutación sin sentido: Crea un codon de parada donde antes no existía.
Mutación de sentido perdido: Cambia el código del RNAm, implicando un cambio en el aminoácido codificado y por tanto en la proteína correspondiente.
Mutación silente: No tiene efecto en la proteína codificada.

ASPECTOS BÁSICOS DE LA BIOLOGIA MOLECULAR (II)
Pocas áreas de la Biología Molecular han permanecido inalteradas con la aparición de una serie de técnicas englobadas dentro del término genérico de Ingeniería Genética y referidas indistintamente como clonaje, DNA recombinante o manipulación genética. Antes del desarrollo de la Ingeniería Genética no era posible aislar un gen concreto eucariótico en cantidades suficientes para su estudio molecular o el de su producto.
LAS ENZIMAS
Existen muchas enzimas que intervienen decisivamente en distintos procesos de la Biologia Molecular. Entre ellas podemos destacar:
Endonucleasas de restricción: Son enzimas que hidrolizan los ácidos nucleicos rompiendo enlaces internucleotídicos del interior de la cadena. Las endonucleasas de restricción son enzimas producidas principalmente por bacterias que hidrolizan enlaces fosfodiester del esqueleto de DNA de doble hebra en secuencias específicas. Las endonucleasas de restricción de tipo II son las más útiles en los métodos de DNA debido a su especificidad de secuencia absoluta, tanto para la reacción de unión como para la de ruptura.

Las enzimas de restricción se denominan con tres o cuatro letras que corresponden a la primera letra del género y a las dos o tres primeras letras de la especie del organismo de procedencia. El número señala el orden cronológico de descubrimiento de esa enzima en esa estirpe.

Casi todas las secuencias nucleotídicas reconocidas por las endonucleasas de restricción poseen un eje de simetría impropio binario, esto es, la lectura de la secuencia en ambas direcciones es la misma, lo que recibe el nombre de palíndromos. La rotura se produce en ambas hebras de DNA siendo esta simétrica respecto al eje binario.

Las endonucleasas de restricción cortan el DNA generando, bien extremos 3´ o 5´ monocatenario, de unos cuatro nucleótidos de longitud, denominados extremos cohesivos, o bien extremos romos.





Polimerasas: Son enzimas capaces de sintetizar DNA o RNA “in vitro”. La mayoría de estas enzimas requieren un molde y sintetizan una molécula complementaria al molde. Las polimerasas utilizadas con mayor frecuencia son: DNA polimerasa I de E. coli, el fragmento de Klenow, transcriptasa inversa (utiliza como molde RNA para convertirlo en DNA), la DNA polimerasa del bacteriofago T7, RNA polimerasa de los bacteriofagos SP6, T7 y T3 y la Taq polimerasa (enzima empleada en la reacción en cadena de la polimerasa). La mayoría de las polimerasas necesitan un pequeño cebador o primer complementario al DNA molde para iniciar la polimerización a partir de ese punto. La transferasa terminal es una polimerasa que no requiere molde y que añade nucleótidos exclusivamente a los extremos de las cadenas preexistentes. Todas ellas requieren Mg2+.

Otras enzimas: Ligasas (une extremos de DNA protuberantes o romos), Fosfatasas (eliminan el fosfato de la región 5´ de los ácidos nucleicos, quinasas (incorporan fosfatos en el extremo 5´ que han dejado las fosfatasas) etc...


LA CLONACION

Consiste en la obtención de un gran número de fragmentos idénticos a partir de uno original. Para ello se aísla primero el fragmento de DNA que se quiere clonar, se liga a un transportador o vector (plásmidos, fagos , cósmidos etc..) que tras introducirlo dentro de una célula va a permitir su replicación por cultivo. Una vez replicado considerablemente se recupera junto con el vector correspondiente y posteriormente se le separa del vector, obteniendo como resultado un gran número de copias del fragmento de interés.




LA ELECTROFORESIS
Es un método que permite la separación de moléculas en base a su tamaño. Esta separación se realiza en un gel, que es una malla compleja de moléculas poliméricas. Los geles pueden ser de agarosa o poliacrilamida. La agarosa es conveniente para separar fragmentos de ácidos nucleicos en el rango desde unos pocos cientos, hasta aproximadamente 20000 pares de bases. La poliacrilamida es preferible para la separación de fragmentos más pequeños de ácidos nucleicos.
El fundamento de esta separación está basado en que las moléculas de ácidos nucleicos están cargadas negativamente (al pH y condiciones del tampón en el que se encuentran) y al someterlas a un campo eléctrico migran hacia el polo positivo de este a través del gel, a velocidades que dependen de sus tamaños: una molécula pequeña puede seguir su camino a través del gel más fácilmente que una molécula grande. Las velocidades de migración de las moléculas de ácidos nucleicos, son inversamente proporcionales a los logaritmos de sus pesos moleculares (Aaij y Borst). La detección tras la migración se realiza fácilmente gracias al empleo de un colorante intercalante (se intercala entre las bases de los ácidos nucleicos) que contiene el propio gel y es visualizado al emitir luz visible cuando el gel se ilumina con luz ultravioleta. Un factor a tener en cuenta para valorar la migración de los ácidos nucleicos en un gel además de su tamaño es la configuración espacial que adopte la molécula.


El peso molecular de los ácidos nucleicos se mide con las siguientes unidades:

· DNA: en pares de bases o bp.
· RNA : en nucleótidos o nt.